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Ataxia telangiectasia mutada y p53 son mediadores potenciales de la resistencia a la cloroquina inducido a Mamaria Carcinogenesis Resumen El uso de agentes para prevenir la aparición de y / o la progresión a cáncer de mama tiene el potencial de reducir el riesgo de cáncer de mama. Hemos demostrado previamente que el gen p53 supresor de tumores es un mediador potencial de la hormona (estrógeno / progesterona) la protección inducida contra la química carcinogeninduced la carcinogénesis mamaria en modelos animales. Aquí, se muestra por primera vez un efecto cancerprotective mama de la cloroquina en un modelo animal. La cloroquina reduce significativamente la incidencia de N - metil - N - nitrosoureainduced tumores mamarios en nuestro modelo animal similar al tratamiento de estrógeno / progesterona. Sin protección se observó en nuestra p53 nula modelo de epitelio mamario BALB / c, lo que indica una dependencia de p53 para el efecto de la cloroquina. El uso de una línea celular humana no tumoral mamaria glándula epitelial, MCF10A, confirmamos que, en ausencia de daño en el ADN detectable, cloroquina activa la p53 supresor de tumores p53 y la p21 aguas abajo del gen diana. resultando en G 1 detención del ciclo celular. la activación de p53 se produce a un nivel posterior a la traducción a través de la fosforilación de la cloroquina dependiente de la proteína kinasa de control, la ataxia telangiectasia mutada (ATM), que conduce a la fosforilación de ATM dependiente de p53. En las células epiteliales de las glándulas mamarias primarias aisladas de ratones p53 null, cloroquina no induce G 1 la detención del ciclo celular en comparación con las células aisladas de los ratones de tipo salvaje, indicando también una dependencia de p53. Nuestros resultados indican que una breve exposición previa a la cloroquina puede tener una aplicación preventiva de la carcinogénesis mamaria. Cancer Res 200 767 (24): 1202633 Introducción El cáncer de mama sigue siendo el principal cáncer entre las mujeres en los Estados Unidos con 200.000 nuevos casos al año (1). Las tasas de incidencia del cáncer de mama están influenciados por la edad, la genética, la radiación, el estatus socioeconómico, la dieta, el origen étnico, y la historia reproductiva. Sin embargo, el factor de protección más fuerte está relacionada con la historia reproductiva, es decir, la edad temprana del primer embarazo (20 años de edad), que confiere un 50 reducción en el riesgo de por vida en comparación con el riesgo de cáncer de mama en mujeres nulíparas (2. 3 ). El efecto protector de embarazo temprano contra química carcinogeninduced carcinogénesis mamaria se ha demostrado en ambos modelos de rata y de ratón (4 6). El efecto del embarazo sobre la protección contra el cáncer de mama inducidos por carcinógenos es imitado por el tratamiento con estrógenos y progesterona (4. 5. 7). Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen en el efecto protector, son poco conocidos. En los estudios que utilizan la rata Wistar-Furth y / c modelos de ratones BALB, puso de manifiesto que la protección inducida por la hormona se manifiesta a nivel celular como un bloque en la proliferación inducida por carcinógeno poco después de tratamiento con el carcinógeno (4. 5. 7). La disponibilidad de la / c p53 nulo modelo de epitelio mamario BALB proporcionado un medio para probar el papel funcional de p53 en la protección inducida por hormonas (8 11). Hemos demostrado que la ausencia de p53 abroga el efecto protector de las hormonas contra el cáncer mamario carcinogeninduced química (10 12). Estos resultados sugieren la hipótesis general de que p53 está regulado de una manera persistente por la estimulación hormonal de la glándula virgen y que las funciones de p53, en parte, para retardar la progresión del ciclo celular en respuesta a inducidos por carcinógenos daño del ADN. p53 puede activarse por varios fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) quinasas relacionadas (PIKK), incluyendo ataxia telangiectasia mutada (ATM), y ATM - relacionado Rad3-(ATR) y el puesto de control ATM aguas abajo efector quinasas Chk1 o Chk2 que fosforilan la NH 2-terminal de dominio de transactivación de p53 en múltiples sitios (por ejemplo, las serinas 6, 9, 15, 20, 37, y 46 refs. 13 17). Estudios recientes mostraron que no sólo el daño del ADN, sino también modificaciones de la cromatina son suficientes para activar la proteína quinasa ATM, que, a su vez, es capaz de activar p53 (18). modificadores de la cromatina, tales como la cloroquina agente antimalárico activan ATM a través de la autofosforilación en la serina 1981, lo que resulta en la fosforilación de p53 en la serina 15 en fibroblastos (18. 19). Además, los miembros de la familia sulfonamida quinolina, tales como cloroquina, inducen la detención del ciclo celular, apoptosis, diferenciación y en líneas celulares de cáncer de mama (20 de 23). Es importante destacar que se ha demostrado recientemente que la cloroquina no sólo reduce la proliferación en modelos celulares, pero perjudica el desarrollo de linfoma espontánea en un modelo de ratón (24). Aquí, una vez más demuestran un efecto protector del cáncer de cloroquina y demostrar que una breve exposición previa a la cloroquina es preventiva contra la N-metil-N - nitrosourea (NMU) inducida por la carcinogénesis mamaria en nuestro modelo de rata similar al tratamiento con estrógeno / progesterona. Sin protección se observó en nuestra p53 nula modelo de epitelio mamario BALB / c, lo que sugiere una dependencia de p53 del efecto cloroquina. Se demuestra que en una línea celular humana no tumoral mamaria glándula epitelial, MCF10A, cloroquina hasta regula la p53 supresor de tumores, p21 aguas abajo de su gen diana que lleva a G 1 la detención del ciclo celular. Estos resultados indican que el efecto protector de la cloroquina tumor puede estar mediado en parte por una ruta de p53. Materiales y métodos Condiciones de cultivo de células de cultivo para las líneas celulares utilizadas en este estudio se han descrito previamente (25). MCF10A es una línea de células epiteliales de mama humano que surgió por inmortalización espontánea de cultivos de células establecida a partir de la inyección s. c. mastectomía de una mujer con enfermedad fibroquística (25). Brevemente, las células MCF10A se mantuvieron en DMEM / F-12 suplementado con 5 de suero de caballo, 0,02 g / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 0,5 g / ml de hidrocortisona, 10 g / ml de insulina, 0,1 g / ml de toxina de cólera, 100 unidades / ml de penicilina, y 100 g de estreptomicina / ml. Las células se trataron con 10 o 50 mol / L cloroquina (Sigma) durante 4, 24, 48, o 72 h. Para los análisis de Western blot, las células se pretrataron con medio que contiene suero de caballo reducida (0,1) durante 24 h. Como controles positivos para varios anticuerpos, las células fueron ya sea - irradiated con 10 Gy o se trataron con 10 mol / L tricostatina A (Sigma). Las células epiteliales de las glándulas mamarias primarias se obtuvieron a partir de 8 semanas de edad, los ratones p53 nulo o p53-WT BALB / c 9. La izquierda y las glándulas mamarias torácicos y inguinal derecha fueron asépticamente eliminado, se reunieron, y se aislaron las células epiteliales de acuerdo con árbitro. 9. Las células se sembraron en matraces recubiertos con colágeno y se cultivaron en DMEM / F-12 suplementado con FCS 2, 5 ng / ml de EGF, 1 mg / ml de albúmina de suero bovino, 10 g / ml de insulina, 50 g / ml de gentamicina , y 20 unidades / ml de nistatina. Short ARN de interferencia Transfección Validado pequeños RNAs de interferencia (siRNA) para p53 y ATM se adquirieron de Dharmacon (si GENOMA de SMART reactivo piscina) y transfectadas transitoriamente en las células MCF10A utilizando TransIT siQuest de Mirus de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. A las 24 h después de la transfección, las células MCF10A se trataron con cloroquina, como se describió anteriormente y se recogieron 24 h más tarde para la proteína y citometría de flujo análisis. Análisis Western Blot Nuclear y extractos citoplasmáticos se prepararon con NEPER kit tampón de lisis (Pierce). Para la transferencia Western, los lisados se resolvieron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa de acuerdo con protocolos estándar. Las transferencias se tiñeron con los siguientes anticuerpos primarios: p53 (FL-393), p53 (DO-1), Chk1 (G-4), Chk2 (A-11) de Santa Cruz Biotechnology murino doble minuto 2 (MDM2 AB-2 ) de Calbiochem p27 (Kip1) y p21 (Cip1 / Waf1) de BD Biosciences Pharmingen acetylp53-K373 / 382, fosfohistona-H2AX-S139 (JBW301), cajeros automáticos de Upstate Bax, phosphop53-S6,9,15,20,37, 46, phosphoChk1-S345, phosphoChk2-Th68 de Señalización celular ATR (BL117) de Bethyl y actina (AC-74, como control de carga) de Sigma. El anticuerpo phosphoATM-S1981 fue proporcionado amablemente por el Dr. M. B. Kastan (18). Las bandas de proteína se visualizaron con anti-conejo o anti-IgG de ratón acoplado a peroxidasa de rábano picante (Santa Cruz Biotechnology), utilizando el kit de quimioluminiscencia potenciada (Amersham) o el Kit de Super Señal West Femto (Pierce). Las cantidades de proteínas se cuantificaron con un densitómetro escáner (Molecular Dynamics). células Citometría de Flujo MCF10A se tripsinizaron en suspensión de célula única, fija en helado de etanol 70, y se almacenaron a 4ºC. Antes del análisis, las células se resuspendieron en 100 g / ml de RNasa A (Promega), 40 g / ml de yoduro de propidio en PBS. Para determinar el porcentaje de células apoptóticas y necróticas, se recogieron y se tiñeron con anexina V FITC y 7-aminoactinomicina D (7-AAD) células tratadas con tripsina, de acuerdo con protocolos estándar. El análisis se realiza en un clasificador de células activadas por fluorescencia Becton Dickinson (FACScan). Las diferencias de las células MCF10A después de tratamiento con cloroquina se examinaron por la t de Student con P 0,05 considerado como estadísticamente significativo. Animales Ratas. Ratas hembras Wistar-Furth se adquirieron de National Cancer Institute. La rata hembra Wistar-Furth es una cepa endogámica de ratas sensibles tanto a NMU - y 7,12-dimetilbenz (a) anthraceneinduced adenocarcinomas mamarios. Las ratas se aclimataron a nuestras instalaciones animal antes de la manipulación experimental. Ratones. Todos los ratones donantes y receptores BALB / c fueron criados y mantenidos en el Baylor College of Medicine. Los ratones donantes fueron homocigotos p53 nula, y los ratones receptores fueron p53 de tipo salvaje (WT ref. 8). Todos los animales fueron alojados mediante el uso de Asociación Americana de Laboratorio Animal Care directrices aprobadas en condiciones de un ciclo de 12 h de luz / oscuridad, y se les permite el acceso ad libitum a comida y agua. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices del NIH para animales de experimentación. Estudios tumorigénesis en ratas Wistar-Furth cloroquina tratada y ratones Balb / c ratas Wistar-Furth. Para los estudios sobre la resistencia a la cloroquina inducida por el carcinógeno a NMU (Sigma), 48 días de edad Wistar-Furth ratas hembra virgen, se administraron tres inyecciones i. p. inyecciones de cloroquina, 3,5 mg / kg de peso corporal, 1 semana de diferencia. A los 63 días de edad, 1 día después de la inyección final cloroquina (el día 62), ratas Wistar-Furth se les dio una inyección i. p. inyección de NMU, 50 mg / kg de peso corporal. Un grupo control de edad de las ratas también recibió inyecciones NMU. Se recogieron todos los tumores mamarios que aparecen en las 35 semanas siguientes, y se procesaron para histología y evaluación patológica. Los tumores fueron evaluados por H rutina de 0,05. los ratones BALB / c. Los conductos mamarios se aislaron a partir de 7 a ratones BALB / c de p53 nulo 8 semanas de edad y se trasplantan en las almohadillas de grasa mamaria de ratones despejadas / c 3 semanas de edad BALB WT. Las muestras de los conductos transplantados crecieron y llenaron la almohadilla de grasa en 6 a 8 semanas. Para cada grupo, dos almohadillas de grasa mamaria se procesaron tal como preparaciones completas a las 8 semanas para examinar la tasa de crecimiento y la morfología de la excrecencia. Esos ratones se trataron por semana durante 8 semanas con la cloroquina (3,5 mg / kg de peso corporal) a partir de las 8 semanas después del trasplante así que los ratones eran 11 a 12 semanas de edad cuando se inició el tratamiento. Los ratones (n 20 por grupo) se palpa semanal para tumores de mama durante 60 semanas postrasplante. Los tumores y tejido no tumoral se evaluaron por H rutina de 0,05. Resultados La cloroquina muestra efectos protectores de cáncer de mama en modelos animales de una manera dependiente de p53. Para investigar si la cloroquina tiene un efecto en el tejido de la glándula mamaria in vivo. diseñamos un experimento en ratas sobre la base de nuestro trabajo anterior demuestra que el tratamiento con estrógeno / progesterona tiene un efecto protector contra los tumores mamarios inducidos por NMU en ratas hembras Wistar-Furth (7). Las ratas se trataron tres veces (una vez a la semana) durante un período de tres semanas con cloroquina (3,5 mg / kg de peso corporal) antes del tratamiento con NMU (50 mg / kg de peso corporal) para inducir adenocarcinomas de la glándula mamaria (Fig. 1 A) . En las ratas no tratadas, la incidencia de tumores de mama fue de 67 (16 de 24) con la primera aparición del tumor a las 8 semanas después de NMU. En comparación, las ratas que recibieron tratamiento con cloroquina mostraron una incidencia de tumor reducido de tan sólo 41 (10 de 24 P 0,05) post-NMU (Fig. 1 A). Además, la tasa de crecimiento de los tumores fue significativamente más lenta que en las ratas tratadas con cloroquina en comparación con los controles no tratados (datos no mostrados). La cloroquina reduce la incidencia de tumores mamarios inducidos por NMU en ratas hembra WT Wistar-Furth pero no muestra efectos protectores de cáncer de mama en a / c p53 nulo modelo de epitelio mamario BALB. Un plan de tratamiento: Wistar-Furth ratas hembra, 48 días de edad, se administraron tres inyecciones i. p. inyecciones de cloroquina, 3,5 mg / kg de peso corporal, de 1 semana de diferencia. A los 63 días de edad, las ratas Wistar-Furth se les dio una inyección i. p. inyección de NMU, 50 mg / kg de peso corporal. Un grupo control de edad de las ratas también recibió inyecciones NMU. Las ratas se palpan semanal para la aparición de tumores y el porcentaje de ratas portadoras de tumor se representaron frente a semanas después del tratamiento NMU. la incidencia de tumores, el número y la latencia fueron evaluados por 35 semanas. Cada grupo contenía 24 animales. la incidencia de tumores y latencias fueron evaluados estadísticamente, y se pusieron a prueba las diferencias entre los grupos para la significación estadística mediante la prueba t de estudiantes de dos caras. Los resultados se consideraron significativamente diferentes a P 0,05). Un modelo de ratón que los atributos biológicos y genéticos imita esenciales de un subconjunto de cáncer de mama humano es el / c p53 nulo epitelio mamario BALB, en el que la supresión de los supresores de tumores p53 en resultados gen mejorada riesgo tumorigénico (8 11). El epitelio mamario p53 nula progresa a través de la hiperplasia ductal y carcinoma ductal in situ antes de convertirse en cáncer de mama invasivo (8 de 11). Debido a que los imitadores de células epiteliales mamarias p53 nula los patrones de expresión se encuentran en subconjuntos de los cánceres de mama invasivos humanos, se investigó la posible p53 de la dependencia de los efectos protectores del cáncer de mama inducido por cloroquina en este modelo. Utilizando este modelo, hemos demostrado previamente que la p53 nula epitelio mamario se desarrolla el cáncer de mama espontánea cuando se trasplantan en ratones WT BALB / c, y mostraron que la ausencia de la función de p53 gen supresor de tumores abroga el efecto protector de los estrógenos / progesterona contra carcinogénesis tumorigénesis inducida en los ratones BALB / c (10 12). En consecuencia, los conductos mamarios se aislaron de los ratones p53 nulo BALB / c y se trasplantaron en ratones WT BALB / c. Los ratones se trataron por semana durante 8 semanas con la cloroquina (3,5 mg / kg de peso corporal) a partir de las 8 semanas después del trasplante (en 1112 semanas de edad). Sin protección se observó en nuestra p53 nula modelo de epitelio mamario BALB / c, lo que sugiere una dependencia de p53 (Fig. 1 B). Es importante destacar que esta es la primera indicación de que la cloroquina puede prevenir el cáncer de mama en un modelo animal similar al estrógeno tratamiento / progesterona y muestra una dependencia p53 apoyar los resultados celulares. La cloroquina inhibe la proliferación celular a través de MCF10A G 1 detención del ciclo celular. Para hacer frente a los mecanismos moleculares por los que la cloroquina impide la tumorigénesis mamaria in vivo. se realizó citometría de flujo para determinar si afecta a la cloroquina del ciclo celular en las células MCF10A en concentraciones que no inducen citotoxicidad significativa. El contenido de ADN de propidio iodidestained se analizaron los núcleos de las células no tratadas y tratadas cloroquina como se muestra en la Fig. 2 A. A las 24 h de incubación, el porcentaje de células en la fase G 1 era 52 en el control, 64 con 10 mol / L, y 76 con 50 de tratamiento / L cloroquina mol (P números similares se produjeron a las 48 y 72 h, datos no mostrados ). Para determinar si la cloroquina induce la apoptosis, además de G 1 la detención del ciclo celular, las células teñidas con anexina MCF10A VFITC (marcador de la apoptosis) y 7-AAD (marcador de necrosis). Como se muestra en la Fig. 2 B. en la población de células MCF10A no tratada solamente 5 de las células experimentan apoptosis, y después del tratamiento con 10 mol / L cloroquina ningún cambio significativo en la apoptosis es detectable. Aunque los resultados de tratamiento de cloroquina 50 mol / L en un aumento de células apoptóticas, el nivel de apoptosis (10 de las células) es aún muy baja, lo que indica que la cloroquina no causa citotoxicidad significativa. En resumen, la cloroquina induce la detención del ciclo celular en las células MCF10A en una concentración / L bajo 10 mol que no induce la citotoxicidad. La cloroquina induce G 1 detención del ciclo celular ya a dosis bajas (10 mol / L), y una ligera apoptosis sólo a dosis más altas (50 mol / L), y hasta regula p53 y sus genes diana aguas abajo mdm2, p27. y en especial el inhibidor de p21 del ciclo celular pero no la proteína bax proapoptótico. Que crecen exponencialmente células MCF10A nontumorigenic fueron tratados durante el tiempo indicado puntos con cloroquina. A, las células recogidas se lisaron en tampón hipotónicamente yoduro de propidio y citometría de flujo perfiles fueron graficados (ejemplo representativo de los experimentos realizados por triplicado). , P 0,05. CQ, la cloroquina. B, las células recogidas se tiñeron con 7-AAD (marcador de necrosis) y Anexina VFITC (marcador de la apoptosis), y el flujo de citometría de perfiles fueron graficados (ejemplo representativo de los experimentos realizados por triplicado). C, se recogieron las células y citoplásmica (bax) o (p53, p21, p27, mdm2) extractos nucleares se sometieron a SDS-PAGE y Western Blot con anticuerpos o de actina como control de carga que se indican, y se cuantificó por densitometría de barrido. Los resultados se muestran como veces de inducción después de la normalización de control de carga (ejemplo representativo de experimentos realizados por triplicado). La cloroquina hasta regula p53 y p21 su gen diana aguas abajo. Debido a la pérdida de p53 abroga el efecto protector del tumor de la cloroquina, el próximo examinó si la cloroquina también induce sobre regulación de p53 en las células MCF10A como se indica anteriormente en los fibroblastos (18) y las células de cáncer de mama MCF7 (22). De hecho, los niveles de proteína p53 se incrementaron en los extractos nucleares de células MCF10A cloroquina se trató a 4 h (1,5 veces a 10 mol / L y 2,7 veces a 50 mol / L) y 24 h (3 veces en 10 y 50 mol / L Fig. 2 C). Aumento en el nivel de proteína p53 nuclear después de tratamiento con cloroquina se confirmó mediante inmunocitoquímica (datos no mostrados). Los aumentos en los niveles de proteína p53 en general reflejan la regulación a posttranscriptional en lugar de en el nivel transcripcional (26 28). De acuerdo con esto, no detectamos cualquier aumento en las transcripciones de p53 después del tratamiento con cloroquina, medido mediante PCR cuantitativa de control y células MCF10A cloroquina tratados (datos no presentados), lo que sugiere que el aumento de los niveles de proteína p53 refleja la regulación a nivel postranscripcional . Para determinar si la detención del ciclo celular cloroquina inducida está asociada con la regulación del ciclo celular p21 inhibidor dependiente de p53, se examinaron los niveles de la proteína p21 después de tratamiento con cloroquina. Como se muestra en la Fig. 2 C. regulación significativa (3 veces a 10 mol / L y 6 veces a 50 mol / L) de p21 (Waf1 / Cip1) se detectó mediante análisis de transferencia Western en nuestro modelo. Además de p21, p27 (Kip1), un miembro de la familia Cip / Kip de quinasa dependiente de ciclina (CDK) inhibidores (29), fue hasta reguladas (hasta 4,7 veces a 10 mol / L) después de 24 h tratamiento con cloroquina (Fig. 2 C). Tanto p21 y p27 desempeñan un papel importante en la detención del ciclo celular a través de la aplicación de G 1 punto de restricción por inhibidora de la unión a cdk2 / ciclina E u otros complejos cdk / ciclina (29). También se examinó el nivel de expresión de Bax, un mediador proapoptótico de la apoptosis dependiente de p53 (30) no se detectó la regulación significativa para bax (Fig. 2 C). Mdm2, una ubiquitina ligasa E3 para p53, juega un papel central a través de un bucle autorregulador p53-Mdm2 para regular la estabilidad de p53 a través de la ubiquitinación y la degradación (31). Debido al aumento de los niveles de p53, también se incrementaron los niveles totales de proteína MDM2 (hasta 6,6 veces a 10 mol / L de 4 h) con tratamiento con cloroquina (Fig. 2 C), consistente con el papel de la MDM2 como un gen diana p53. Tomados en conjunto, mostramos inducida por cloroquina sobre regulación de p53 y p21, los actores clave para la detención del ciclo celular G1 en las células MCF10A similares a nuestro modelo de protección de estrógeno / progesterona. Se requiere p53 para el G 1 detención del ciclo celular inducida por la cloroquina de las células MCF10A. Para determinar si hay un requisito funcional para p53 en el G 1 detención del ciclo celular inducida por la cloroquina, la citometría de flujo de tinción de yoduro de propidio se realizó en las células p53-siRNAtransfected MCF10A, y la expresión de p53 se controló por transferencia de Western. Como se muestra en la Fig. 3 A. no se detectó aumento de la detención del ciclo celular G 1 después de / L tratamiento con cloroquina 10 mol en células transfectadas con p53-siRNA. Por otra parte, el tratamiento con p53-siRNA abolió la estimulación cloroquina de la p21 regulador del ciclo celular (Fig. 3 B). Se requiere p53 para la cloroquina inducida sobre regulación de la p21 inhibidor del ciclo celular (Waf1 / Cip1) y para G 1 detención del ciclo celular. A, las células MCF10A se transfectaron transitoriamente, ya sea con el control de siRNA o p53 siRNA, fueron tratados con cloroquina (24 h), y el flujo de citometría de perfiles se representaron gráficamente (ejemplo representativo de los experimentos realizados por triplicado). , P 0,05. Para confirmar aún más el requisito funcional de p53, aislamos las células epiteliales de las glándulas mamarias primarias de nuestro WT y ratones p53 nulo BALB / c. Citometría de flujo perfiles de contenido de ADN nuclear reveló que la cloroquina promueve la detención G ciclo 1 de células sólo en las células p53-WT, pero no en las células p53 nulo ni en 10 mol / L (Fig. 3 C), ni a 50 mol / L ( datos no mostrados). Por lo tanto, se requiere p53 para el G 1 detención del ciclo celular cloroquina inducida en células epiteliales mamarias nontumorigenic. La cloroquina provoca la fosforilación de p53. El nivel de la actividad de p53 está regulada por una variedad de modificaciones posteriores a la traducción, incluyendo la fosforilación y la acetilación que se activan por estímulos distintos (13 15. 32 34). Para determinar si la exposición de las células epiteliales mamarias a la cloroquina resultados en la modificación covalente de p53 en las células MCF10A, se analizaron el estado de fosforilación y la acetilación de p53 mediante transferencia Western. p53 puede ser activado por varias quinasas que fosforilan sobre todo el dominio de transactivación del terminal NH2 de p53 en múltiples sitios (por ejemplo serinas 6, 9, 15, 20, 37, y 46 refs. 13 15). Nuestro análisis de el estado de fosforilación de estos residuos utilizando anticuerpos fosforilación sitespecific mostró que el tratamiento con cloroquina de las células MCF10A aumento de la fosforilación p53 solamente en la serina 15 (8,2 veces a 10 mol / L y 11 veces a 50 mol / L para 24 h), un sitio de fosforilación de p53 cruciales que pueden ser fosforilados por ATM y que juega un papel importante en la actividad funcional p53 (refs. 35. 36 la Fig. 4). El curso temporal de la fosforilación de p53 inducida por la cloroquina en la serina 15 correlacionada con la estimulación de la producción de p21 cloroquina (Fig. 2 C). Por el contrario, la fosforilación de la serina 46, que se ha demostrado que estar vinculada a la transactivación de los genes diana de apoptosis (37), no aumentó con el tratamiento con cloroquina. Este resultado es coherente con nuestra citometría de flujo datos que muestran que la cloroquina induce sólo una ligera apoptosis en cantidades altas (Fig. 2 B). La fosforilación de la serina de p53 15 por cloroquina. La cloroquina causa p53 serina 15 fosforilación. MCF10A células fueron tratadas durante el tiempo indicado puntos con cloroquina. Las células se recogieron y los extractos nucleares se sometieron a SDS-PAGE y Western Blot con p53 o los anticuerpos fosforilados y acetilo indicados, y se cuantificaron por densitometría de barrido. Los resultados se muestran como veces de inducción después de la normalización de control de carga (ejemplo representativo de experimentos realizados por triplicado). El terminal COOH de p53 también juega un papel clave en la regulación de la función de p53 es rica en lisinas, que se someten a acetilación, ubiquitinación, y sumoylation (32 34). La fosforilación de serina 20 y 46 refuerza la asociación con el p300 acetiltransferasas y CBP, que conduce a la acetilación en lisinas 373 y 382 en el dominio regulador COOH-terminal (13). Esto aumenta la actividad de unión al ADN de p53 y modula su interacción con factores de transcripción (32 34). De acuerdo con nuestros datos que no muestran la fosforilación significativa en la serina 20 o 46, que no detectó ningún aumento de p53 acetilado después del tratamiento con cloroquina (Fig. 4). Estos resultados sugieren una serina 15 modulación selectiva de p53 se produce después de la cloroquina. La cloroquina fosforila p53 a través de la vía de señalización ATM. la fosforilación de p53 en la serina 15 se transduce principalmente a través de la ATM PIKKs, ATR, y la proteína quinasa de ADN activado (DNA-PK ref. 13), que predice que los inhibidores de la familia PI3K de las enzimas deben suprimir la fosforilación cloroquina inducida por p53. Para probar este concepto, las células MCF10A se trataron con cloroquina en presencia o ausencia de wortmanina, un inhibidor de PIKK ATM y DNA-PK (38). Wortmanina completamente bloqueado mediada por serina ATM 15 la fosforilación de p53 en nuestro modelo (datos no presentados), lo que sugiere un requisito PIKK para serina 15 fosforilación. Dado que los estudios anteriores han indicado que la cloroquina puede activar ATM por la fosforilación en la serina 1981 en células de fibroblastos (18. 19), próxima pregunta si la inhibición específica de ATM utilizando la interferencia de ARN abroga la fosforilación de p53 de la serina 15. Como se muestra en la Fig. 5 A. tratamiento con ATM-siRNA abolió completamente la inducción cloroquina de fosforilación de la proteína p53 en la serina 15. La cloroquina activa p53 a través de la vía de señalización de ATM, pero no genera ADN doble filamento se rompe o hyperacetylation histona. Una, la baja regulación de la fosforilación de p53 suprime ATM cloroquina inducida en la serina 15 (24 h). MCF10A células fueron transfectadas transitoriamente con cualquiera de los controles-siRNA o ATM-siRNA. Las células se recogieron y los extractos nucleares se sometieron a SDS-PAGE y Western Blot con anticuerpos indicados (ejemplo representativo de experimentos realizados por triplicado). B, cloroquina induce la fosforilación en la serina ATM 1981. Las células fueron tratadas con cloroquina para los puntos de tiempo indicados, se procesaron para análisis de Western blot con anticuerpos indicados, y se cuantificaron por densitometría de barrido (pliegue de inducción después de la normalización de la carga a controlar ejemplo representativo de los experimentos realizados por triplicado ). C, las histonas se purificaron y se utilizan en experimentos de transferencia Western con anticuerpos acetil indicados, y la histona 3 como control de carga. PhosphoH2AX-serina 139 de anticuerpo fue utilizado como un marcador de ADN-rotura (ejemplo representativo de experimentos realizados por triplicado). Para determinar si el tratamiento con cloroquina regula la fosforilación de ATM en las células MCF10A, se realizó transferencias de Western con un anticuerpo phosphospecific a la serina 1981 de la ATM. Como se muestra en la Fig. 5 B. ATM se fosforiló específicamente en los extractos de la cloroquina tratados nucleares (6 veces a 10 mol / L y hasta 21 veces en 50 mol / L de 4 h), en condiciones en las que la proteína p53 es fosforilada en la serina 15. Curiosamente, ATM efectores aguas abajo Chk1 (16) y Chk2 (17) sólo mostró aumento de la fosforilación en el punto de tiempo más tarde, en respuesta a la cloroquina (hasta 5 veces en 10 y 50 mol / L a las 24 h Fig. 5 B), y ATM-siRNA todavía abolido la fosforilación inducida por cloroquina de p53 en la serina 15 en este punto de tiempo más tarde (24 h Fig. 5 a). La proteína quinasa ATM puede ser activada por el daño del ADN o por modificaciones de la cromatina, tales como la acetilación de (18. 19). Por lo tanto, a fin de determinar si la activación cloroquina de la vía de señalización de ATM era debido a la formación de ADN de doble filamento se rompe. transferencia de Western de extractos de histona aisladas mostró que en las células MCF10A, cloroquina no induce la fosforilación de H2AX en la serina 139, un marcador conocido rotura del ADN (39), en comparación con la irradiación, lo que sugiere que la cloroquina no activa la fosforilación mediada por la ATM de p53 a través de la inducción de ADN de doble filamento se rompe en las células MCF10A (Fig. 5 C). Además, no detectamos ningún hyperacetylation histona después del tratamiento con cloroquina (Fig. 5 C). En conjunto, nuestros datos indican que la cloroquina se puede utilizar en células epiteliales mamarias nontumorigenic, similares a fibroblastos (18), para activar la p53 supresor de tumores a través de la vía de la cinasa ATM sin daño en el ADN detectable. Discusión Presentamos aquí que los efectos preventivos del embarazo precoz o la exposición a los estrógenos / progesterona (4. 7) en contra de la carcinogénesis mamaria se pueden recapitulan por el tratamiento previo a corto plazo de las ratas con la cloroquina. La primera indicación de que la cloroquina puede ser útil para la prevención del cáncer más adelante, además del tratamiento de la malaria y enfermedades reumatoides, vino de un estudio reciente que muestra que el tratamiento con cloroquina crónica afecta lymphomagenesis espontánea en modelos de ratón (24). Nosotros y otros han demostrado previamente que el tejido mamario en los roedores jóvenes es muy susceptible a los efectos protectores del embarazo o durante el embarazo los niveles de estrógeno / progesterona (4. 5. 7). Del mismo modo, las mujeres que se han sometido a un embarazo a término temprano en la vida son 50 menos probabilidades de desarrollar cáncer de mama en comparación con las mujeres nulíparas (2. 3). Por lo tanto, tomamos el enfoque para administrar cloroquina sólo por un período de 2 semanas en ratas jóvenes para examinar si la cloroquina puede ser utilizado en la prevención de la carcinogénesis mamaria. La prevención de la carcinogénesis mamaria por cloroquina fue significativa, y era igual de eficaz de lo que hemos observado previamente con dosis más bajas de tratamiento de estrógeno / progesterona (4. 5. 7). Sin embargo, sólo dio a las ratas tres inyecciones de cloroquina, 3,5 mg / kg de peso corporal, durante el régimen de tratamiento de 2 semanas. Por lo tanto, mediante la optimización de la dosis de cloroquina, es de esperar una respuesta aún mayor. Estudios previos han indicado que, aunque la cloroquina no muestra muchos efectos secundarios durante el uso a largo plazo para el tratamiento de la malaria o enfermedades reumatoides, los problemas de la retina son un efecto secundario potencial (40). Sobre la base de las directrices de seguridad oftalmológicas para uso a largo plazo de la cloroquina en los seres humanos (40), la cloroquina puede ser administrado con la dosis baja de 3,5 mg / kg de peso corporal al día durante varios años. Por otra parte, la cloroquina muestra dos características farmacológicas interesantes, extensa acumulación de tejido y la retención prolongada en los tejidos después de la administración del fármaco ha cesado (41). La cloroquina se ha demostrado que ser retenido en el cuerpo durante varias semanas después de una única inyección i. v. la dosis similares a las condiciones en nuestro modelo animal (42) y se alteró el lymphomagenesis espontánea en modelos de ratones con esta dosis baja (24). Por lo tanto, nuestro resultado de la protección cloroquina inducida contra la carcinogénesis mamaria en niveles tan bajos es muy significativo y prometedor. Hemos demostrado previamente que el estrógeno / prevención progesteroneinduced de la carcinogénesis mamaria inducida por carcinógeno en roedores se asocia con la regulación de la p53 supresor de tumores. Esto da lugar a p53 dependiente de la regulación de p21, lo que lleva a la detención del ciclo celular y un fenotipo mamaria que es refractaria a la carcinogénesis (4. 5. 7). El papel esencial de p53 se muestra mediante la supresión del fenotipo refractario en el epitelio mamario derivadas de ratones p53 nulo (10 12). Como se ha visto con el tratamiento con estrógenos / progesterona, donde abrogación de p53 disminuye los efectos protectores, mostramos que en ausencia de p53, se pierde la protección cloroquina inducida contra la carcinogénesis mamaria en la detención del ciclo celular vivo e in vitro.
